За последние 60 лет были разработаны инновационные методы секвенирования следующего поколения (NGS), которые исследователи и клиницисты используют для диагностики, мониторинга и лечения заболеваний и расстройств путем определения зародышевой линии или соматических мутаций. Ученые в различных областях используют технологии секвенирования нового поколения для определения последовательности цепи нуклеиновой кислоты, такой как ДНК или РНК, за несколько дней или даже часов. Хотя технологии NGS являются относительно новыми для медицинской и научной сферы, эти технологии быстро переопределили геномные исследования.
SMRT- секвенирование и секвенирование нанопор
Двумя основными методами длительного считывания NGS являются секвенирование одной молекулы в реальном времени (SMRT) и секвенирование нанопор. Секвенирование SMRT включает в себя циркулирование цепей ДНК и использование полимеразы для интеграции меченых оснований, которые излучают свет при интеграции. Исследователи обнаруживают свет и используют его для измерения включения нуклеотидов в режиме реального времени. Между тем, секвенирование нанопор предполагает измерение изменений электрического тока при прохождении нитей ДНК через белковую нанопору. Затем они расшифровывают изменения, чтобы расшифровать последовательность.
Хотя эти методы в настоящее время находятся на переднем крае NGS, эти технологии прошли долгий путь с момента появления NGS. Здесь мы погрузимся в путешествие, которое NGS предприняла с момента открытия базовой структуры ДНК в виде двойной спирали в 1950-х годах.
История секвенирования следующего поколения
С момента открытия базовой структуры ДНК в виде двойной спирали ученые посвятили много времени и усилий пониманию молекулярных структур ДНК. С 2003 года, когда был завершен проект «Геном человека», ученые направили свои усилия на разработку методов NGS. В результате сегодня ученые могут секвенировать весь геном человека в течение дня и по цене ниже 1000 долларов.
Разработки 1970-х годов
Пол Берг разработал первую технологию секвенирования ДНК в 1972 году. Эта технология позволила выделить определенные фрагменты ДНК и проложила путь для развития современной генной инженерии. До появления этой технологии ученые использовали для секвенирования только фаги и ВИРУСНУЮ ДНК.
Затем, в 1973 году, Уолтер Гилберт опубликовал первую нуклеотидную последовательность. Эта последовательность состояла из 24 пар оснований оператора lac ДНК. Несколько лет спустя, в 1977 году, Фредерик Сэнгер, как известно, секвенировал первый полный ДНК-геном бактериофага (phi X174). Он продолжил разработку метода “секвенирования ДНК с помощью ингибиторов, обрывающих цепь”, который Уолтер Гилберт расширил, разработав метод “секвенирования ДНК методом химической деградации”.
Разработки 1980-х годов
Почти десять лет спустя, в 1986 году, Лерой Худ объявил о новом изобретении — первой полуавтоматической машине для секвенирования ДНК в Калифорнийском технологическом институте. Исследователи и ученые использовали эту машину для картирования и секвенирования генетического материала. Перенесемся на год вперед, в 1987 год, когда компания Applied Biosystems выпустила на рынок ABI370, первую автоматическую секвенирующую машину, которая позволила продвинуться в нескольких исследовательских проектах.
Разработки 1990-х годов
В 1990 году был официально запущен проект «Геном человека», в котором приняли участие исследовательские группы в США, Великобритании, Германии, Франции, Японии, Китае и Индии. Забегая вперед на несколько лет, в 1998 году Эрик Кавасима, Лоран Фаринелли и Паскаль Майер концептуализировали «Метод амплификации нуклеиновых кислот” в Женевском институте биомедицинских исследований, что стало ключевой вехой в истории NGS.
Разработки 2000-х годов
К 2000 году проект «Геном человека» использовал достижения геномики и анализа последовательностей для завершения чернового проекта генома человека. С этого момента компания Lynx Therapeutics, которую позже купила Illumina, запустила технологию массового параллельного сигнатурного секвенирования (MPSS). Затем международные исследователи завершили проект «Геном человека», который занял в общей сложности 13 лет и обошелся примерно в 2,7 миллиарда долларов.
Начиная с 21-го века, разработчики усовершенствовали больше методов NGS, предлагая экономичные, действенные, быстрые и точные методы секвенирования, которые предлагали значительные улучшения по сравнению с устаревшим методом Сэнгера. Сначала, в 2004 году, 454 Life Sciences выпустили Roshe GS20, технологию пиросеквенирования нового поколения и первую платформу NGS на рынке. Эта платформа изменила процесс секвенирования ДНК, сделав возможным получение до 20 миллионов пар оснований.
Затем, в 2008 году, была опубликована первая статья об использовании секвенирования следующего поколения для изучения последовательности генома человека. В том же году ученые впервые использовали NGS для получения единого генома: личная последовательность генома Джеймса Уотсона оценивалась в 1 миллион долларов.
В 2014 году Illumina выпустила секвенсор HiSeq X Ten и заявила, что создала первый геном стоимостью 1000 долларов (хотя для достижения этого рубежа потребовались первоначальные инвестиции в десятки миллионов долларов). Благодаря этому развитию Illumina монополизировала отрасль; компания занимала 70% рынка ДНК-секвенсоров и на ее долю приходилось более 90% всех данных о ДНК, производимых в мировом масштабе.
Затем, в 2018 году, Veritas Genetics предложила секвенирование всего генома всего за 199 долларов 1000 клиентам. Год спустя, в 2019 году, Национальный исследовательский институт генома человека сообщил, что цена секвенирования полного генома человека упала до 942 долларов, превзойдя прогноз Закона Мура.
Технологии секвенирования следующего поколения продолжают развиваться
Сегодня исследователи и ученые используют технологии NGS в нескольких приложениях, таких как метагеномика, секвенирование РНК и всего генома. По мере того, как разработчики будут продолжать модернизировать эти технологии, мы увидим, что они становятся эффективными и доступными решениями во все большем количестве лабораторий геномики. Например, новейшие технологии NGS уже позволяют получить точное представление о нуклеиновых кислотах клеток на определенной фазе благодаря использованию методов секвенирования отдельных клеток. Эти технологии позволяют избежать необходимости в усредненных показаниях образцов, которые могут ввести в заблуждение.
Разработчики также оттачивают новые методы пространственного секвенирования, которые ученые могут использовать для секвенирования непосредственно из образца. Такие методы обеспечивают особое разрешение данных и позволяют исследователям исследовать состав клеток и взаимодействия в их естественной среде. Эти методы также минимизируют время и стоимость секвенирования при максимальной точности.